银杏叶提取物对肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响

对照，时间均为1周，第8天处死所有动物。

1.2 小鼠一般情况及结肠病理组织染色

观察动物的体重、毛发光泽度、精神状态、大便性状、活动情况、食欲等。造模后处死小鼠，取部分结肠组织置于多聚甲醛内固定、包埋、切片，HE染色，行组织病理学观察。

1.3 脂多糖（LPS）含量的测定

实验结束后，应用注射器行心脏穿刺取血，取血后以3000 r/min离心15 min，取出血清，按试剂盒说明书应用偶氮基质显色法测定LPS含量。

1.4 结肠黏膜的通透性的检测

实验结束前4 h动物禁食水，应用FITC-D灌胃，（60 mg FITC-D/100 g），然后采取血清，应用荧光分光光度计检测每个样本的荧光密度，计算出每只小鼠血清中FITC-D的浓度。

1.5 肠系膜淋巴结细菌移位率的检测

实验结束后，用无菌剪刀剪取小鼠的全部肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph nodes，MLN），称重后并匀浆，将匀浆组织各0.1 mL分别涂在普通琼脂培养基上37℃孵箱中培养24 h。计算细菌移位率，细菌移位率=（阳性的只数/培养的总只数）×100%。

1.6 结肠黏膜免疫组织化学及荧光染色

实验结束后，截取结肠组织行冰冻切片，严格按照实验步骤，一抗Claudin-1、occludin蛋白在37℃孵育2 h，洗涤，二抗37℃孵育30 min，结束后在光镜下观察Claudin-1、occludin蛋白的表达。免疫荧光染色：其他步骤同上，二抗滴加标记红色荧光的抗小鼠Cy3，室温1 h，红色的亮光为阳性表达。在阴性对照组中应用PBS替代一抗，其他的方法同上。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的一般情况

正常组的小鼠大便、饮食、精神状态正常、体重增加、毛发光泽；模型组小鼠第1天一般状况较正常；第3天开始出现食欲、体重下降，精神萎靡，懒于活动，毛发无光泽，拉稀便或黏液血便；第5天上述各种症状明显加重，粪便潜血试验呈强阳性；第7天小鼠体重减轻明显，肛周可见肉眼血便。EGB 761组第5～7天后，稀便，未见脓血便，状态接近正常，但体重仍明显减轻。

2.2 EGB 761对小鼠结肠组织病理学表现的影响

正常组小鼠结肠黏膜光滑，无水肿、充血等表现；模型组结肠黏膜缺损，可见黏膜、黏膜下层大量炎症细胞浸润，隐窝增生；EGB 761组可见炎症细胞浸润少，炎症程度较模型组明显减轻。见图1。

2.3 EGB 761对血清LPS、细菌移位率及FITC-D渗透率的影响

与模型组比较，正常组及EGB 761组血清中LPS的含量、结肠黏膜FITC-D渗透率、细菌移位率明显降低（P < 0.01）。见表1。

2.4 免疫组织化学染色法检测Claudin-1、occludin蛋白定位分布

通过光镜观察正常组Claudin-1、occludin蛋白，阳性细胞主要呈棕黄色或褐色，分布于结肠组织上皮细胞的边缘以及细胞膜的顶端，均匀连续分布；模型组的蛋白分布不均染色变淡，线条模糊，边缘粗糙有刺状突起；EGB 761组Claudin-1、occludin蛋白在结肠黏膜上皮层中分布均匀，线条清晰。见图2～3。

2.5 免疫荧光染色检测结肠黏膜occludin和Claudin-1蛋白的定位分布

在激光共聚焦的显微镜下看到的Claudin-1和occludin蛋白均呈红色光亮，在正常组中Claudin-1、occludin蛋白染色可见红色的亮光沿细胞的胞膜分布，呈强光，细胞的胞膜边缘较光滑；在模型组中可见看到，红色的光亮沿细胞胞膜散在分布，荧光强度减弱；EGB 761组荧光仍沿胞膜分布，强度较强于模型组。见图4～5（封三）。

3 讨论

UC是一种病因不明的、高复发的肠道炎症性疾病，研究显示UC在各种微生物抗原刺激下，肠黏膜屏障通透性增高，使肠道致病菌群穿过黏膜屏障，激活体内免疫系统被激活，各种炎症细胞活化，肠黏膜组织产生炎性反应，而肠黏膜通透性，居于中心地位，可能是UC发病的始动因素，所以提高肠道黏膜屏障，降低其通透性可能为该病提供一个新思路。 在正常的情况下，肠道有完整的黏膜屏障，可以阻止有毒物质通过[13-16]，UC发病时，肠黏膜屏障通透性增高[17-18]。

GBE 761广泛用于治疗呼吸系统、心脑血管系统等疾病，有调节循环系统、改善血液循环、保护组织等作用。GBE 761可通过抑制炎症细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子-α、NF-κBp65、白介素-6，从而对大鼠实验性结肠炎具有保护作用，同时GBE 76灌肠也能抑制大鼠结肠炎的炎症细胞因子的分泌，减轻肠道炎性反应，减少肠黏膜的损伤[19-20]。

实验结果显示，GBE 761干预有促进动物食欲效果导致动物体重迅速增加；减少肠道出血和炎症细胞的浸润，正常组FITC-D含量、细菌移位率及LPS的含量降低。GBE 761干预使紧密连接蛋白分布于细胞边缘，沿细胞膜分布，加强了紧密连接，降低了黏膜的通透性；由此可见，GBE 761可降低肠黏膜通透性、降低肠道炎性反应，减轻肠黏膜病理反应，对UC的治疗有一定作用。

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