活的但非可培养（VBNC）状态细菌的研究进展
关键词：活的但非可培养（VBNC）;细菌;诱导;复苏
文章编号：1673-8640（2018）-0039-03
中图分类号：X53
文献标志码：B
传统的微生物共识将活性等同于可培养性，认为当细菌细胞不再能在传统培养基上生长时即为死亡。现在我们知道这一假设过于简单了，有很多情况是细胞失去了培养性但仍保留着活性和潜在的重新生长能力。本文就什么是VBNC，致VBNC的诱导因素，进入VBNC后细菌的变化，能进入VBNC的细菌，检测VBNC的方法等作一综述。
VBNC是什么
处于活的但非可培养（VBNC）状态的细菌不能在常规细菌培养基上生长和形成菌落，但仍具有代谢活性及致病力，只是代谢活性低，其在复苏后可再次获得可培养性。[1]典型的活的但非可培养反应是：细菌暴露于一个或多个环境压力下，菌落形成单位数规律的减少。然而在减少的这一过程中，总的细胞数几乎保持着一个常数不变。（图1）[2]
VBNC状态是细菌对一些自然压力，如饥饿，温度，氧浓度，渗透压浓度，紫外线照射等的一种反应方式，如果细胞不进入这一休眠状态，这些环境压力可能是致死性的。Klancnik等[3]将肉汤增菌后的空肠弯曲菌K49/4菌悬液經离心，收菌，洗涤后重悬于Ringer溶液中，孵育24h～42d得到空肠弯曲菌饥饿细胞。可培养性用在Karmali琼脂板上克隆形成单位（CFU/ml）来评估，总细胞计数和活细胞计数用LIVE/DEAD BacLight 活性包评估。长达42d的平行计数活的和可培养细胞证实了空肠弯曲菌细胞转变到了一种VBNC状态。同样的，Pawlowski等[4]报道鼠疫耶尔森菌能以VBNC状态长期存活于4℃水中。
在利用温度和氧浓度诱导的研究中，Rollins等[5]研究了温度和氧气浓度对空肠弯曲菌HC菌株在水中存活的影响，发现空肠弯曲菌在37 ℃培养时10 d即可进入VBNC状态，而4 ℃培养时120d才进入VBNC状态。同时指出经振荡的空肠弯曲菌菌悬液受氧气的影响进入不可培养状态的时间有所缩短。
此外，pH[6]等也可诱导空肠弯曲菌进入VBNC状态;Said等[7]检测到经紫外线处理过的水中存在大肠杆菌活的但非可培养状态细胞;Campo等[8]报道铜处理可诱使黄单胞菌进入VBNC状态。另外，许多研究已经发现，一些常规的，本该是杀死细菌的灭菌程序，可能并没有杀死细菌， 而是诱使细菌以VBNC的状态存留了下来。例如， 牛奶的巴氏灭菌以及废水的氯化杀菌。[9]
进入VBNC后细菌的变化
进入VBNC状态的细胞体积通常会变大，并发生许多新陈代谢变化，如营养物质的转运减少、呼吸速率降低、细胞内钾离子浓度及膜电势降低、细胞内外pH差别变小、大分子物质的量合成下降等。然而生物合成并没有停止，而是在这一时期，合成出了新的饥饿和冷休克蛋白。在死亡和即将死亡的细胞中迅速降低的ATP水平在VBNC细胞中仍然保持较高水平，VBNC细胞仍存在基因表达。[10]Tangwatcharin等[11]报道空肠弯曲菌VBNC光学显微镜显示其由螺旋状变为了球状，透射电镜则显示其细胞外膜在后期的细胞悬浮液中消失。Lazaro等[12]研究发现在长时间暴露于低温条件下不可培养的空肠弯曲菌仍保留着完整的染色体DNA并且可在琼脂蛋白凝胶上得到与0d新鲜可培养细胞一样的易识别的条带。
哪些细菌可进入VBNC
现已报道约有60多种生物[13]存在VBNC，包括沙门氏菌属（ Salmonella spp.）、志贺氏菌属（ Shigella spp.）、肠球菌属（ Enterococci ） 、弧菌属（ Vibrio spp.）、弯曲杆菌（ Campylobacter spp.）、大肠杆菌（ Escherichia coli） 、土拉弗氏菌（ Francisella tularensis） 、幽门螺杆菌（ Helicobacter pylori） 、空肠弯曲菌（ Campylobacter jejuni） 、军团菌（ Legionella pneumophila） 、单核细胞增生性李斯特菌（ Listeria monocytogenes ） 、结核分支杆菌（ Mycobacterium tuberculosis） 、铜绿假单胞杆菌（ Pseudomonas aeruginosa ） 等。其中包括了很多致病菌，霍乱弧菌（ Vibrio cholerae ） 、副溶血弧菌（ Vibrio parahaemolyticus） 、创伤弧菌（ Vibrio vulnificus） 、大肠杆菌（ Escherichia coli） 及粪肠球菌（ Enterococcus faecalis） 等。
如何检测VBNC
常用的检测细菌VBNC状态的方法有活菌直接计数法（ direct viable counting ，DVC） 、细胞完整性检测、核酸染色法检测、呼吸检测、流式细胞术、分子生物学技术等[14]。
一、活菌直接计数法（ direct viable counting ，DVC）DVC法是目前检测VBNC 状态细胞活性最常用的方法之一。它的具体方法为：在培养基中添加适量酵母浸膏等营养物和少量萘啶酮酸（DNA合成抑制剂） ，培养6h后用戊二醛或甲醛固定，吖啶橙染色，在荧光显微镜下观察。如细胞变粗伸长不分裂则说明其具有活性。再结合平板计数法就能确定细菌是否处于VBNC 状态并能够确定细菌的个数。Federighi等[15]用活菌直接计数法，CTC-DAPI双染法计数水中非球状空肠弯曲菌，并证实VBNC状态的存在。
二、细胞完整性检测利 用LIVE/DEAD backlight bacterial viability kit（Molecular probes）进行镜下检测，该试剂盒中含有两种染料，分别是SYTO 9 和PI ，A 480/450 nm时，SYTO 9 将活细菌和死细菌都染色并呈现绿色荧光;PI （Propidium iodide） 只能通过破损的死菌细胞壁渗透到死菌体内，并降低SYTO 9 的染色效果，在波长A 490/635 nm，呈现红色荧光。研究者可通过荧光下细菌所呈现的不同颜色来区分活菌和死菌。李影等 [16]用荧光染料SYTO-9和PI计数大肠杆菌VBNC。鄂佳等[17]用此法检测计数到粪肠球菌VBNC。