心脏胶原蛋白中交联氨基酸的质谱分析

摘 要 心脏衰竭可能与心脏胶原蛋白交联异常有关，因为交联过程对心脏胶原蛋白的机械强度起决定作用。研究表明，某些交联氨基酸的含量可以用作对应胶原蛋白交联异常的分子标记，但心脏胶原蛋白交联异常的分子标记尚不清楚。本研究建立了串联质谱的分析方法可以高选择性的检测水解胶原蛋白质中两种重要的交联氨基酸-吡啶诺林（PYD）和去氧吡啶诺林（DPD）。在小鼠心室胶原蛋白酸性水解产物中检测到DPD，未检测到PYD，说明PYD与心脏胶原蛋白的交联过程无关，而DPD在心脏胶原蛋白交联中起更重要的作用，有可能成为与心脏衰竭相关的分子标记。本研究提供了一种基于质谱的研究心脏胶原蛋白交联产物的方法，也可用于其它胶原蛋白的分析。

关键词 心脏衰竭；胶原蛋白；交联氨基酸；质谱; 母离子扫描

1 引 言

胶原蛋白是哺乳动物体内最主要的蛋白质，约占蛋白质总量的30%^[1]。胶原蛋白主要分布于细胞间质，常形成纤维结构，为多细胞生物提供细胞间的机械支撑。而胶原蛋白的机械强度取决于蛋白质亚单位之间通过共价键形成的交联程度。因为交联可稳定胶原蛋白的纤维结构并提供足够的强度和粘弹性以实现各种结构功能。交联程度和形成纤维的数量，密度，取向和尺度决定了胶原蛋白的种类和功能^[2]。例如，人体内的I型胶原蛋白（如心脏胶原蛋白）由3条α链组成，每条α链分子量约100 kDa （约1000个氨基酸残基），3条α链相互间通过羟脯氨酸残基之间的氢键作用构成紧密稳定的左旋三股螺旋结构（γ）^[3,4]。几乎所有纤维化的胶原蛋白的交联都是在赖氨酰氧化酶作用下通过赖氨酸或羟赖氨酸的侧链醛基化而实现的^[5]。发生在两条侧链间的交联被称作二价交联；若三条链参与，则是三价交联或成熟交联。多种不同的交联方式可能同时存在于一种纤维状胶原蛋白中^[6]。此外赖氨酰氧化酶的活性可以被β-氨基丙腈，EDTA，D-青霉胺及其它羰基试剂抑制。

近年来，交联过程在临床医学上的重要性引起了广泛关注。例如，当细胞间质的成分因血压升高而发生变化时，细胞间质纤维胶原蛋白的合成，降解，以及交联均可能引发心脏衰竭^[7,8]。研究还发现血压升高会引起心脏纤维胶原蛋白总量，胶原蛋白交联的比例，及赖氨酰氧化酶活性的显著变化。而且基因表达，酶活性及交联过程还与心室刚度相关联^[9]。统计表明， 高血压每年造成全球500万人早亡，占世界总死亡人数的13%，其中美国约2万人^[10]。所以，研究心脏胶原蛋白的交联，心室刚度，赖氨酰氧化酶活性及基因调控之间的关系有重要的科学意义和应用前景。本研究将着重阐述如何建立串联质谱法来鉴定存在于胶原蛋白中两种常见的结构近似的交联氨基酸--吡啶诺林（PYD）和去氧吡啶诺林（DPD），为进一步研究交联作用与心脏疾病间的关系提供分析支持。吡啶诺林（PYD）和去氧吡啶诺林（DPD）是软骨和骨骼中常见的三价交联产物^[11]。文献多关注于它们作为生物分子标记在胶原蛋白代谢中的作用^[12,13]。例如，高于正常的吡啶诺林及羟赖氨酸被视作成骨不全症的标志^[14]，以及通过检测尿中的PYD和DPD含量来监测骨病^[15]。而由于心脏胶原蛋白的复杂性及方法的限制，目前关于PYD和DPD在心脏胶原蛋白中的作用尚不清楚。本研究将通过串联质谱法检测胶原蛋白水解产物中的PYD和DPD，并揭示PYD和DPD与心脏胶原蛋白交联的关系。

2 实验部分

2.1 实验试剂

吡啶诺林（PYD）和去氧吡啶诺林（DPD），购自Quidel （San Diego, CA, USA）。HPLC级甲醇，水，乙腈，乙酸，三氟乙酸（TFA）均购自Sigma-Aldrich （St. Louis, MO, USA）。

2.2 样品准备

2.2.1 小鼠心脏胶原蛋白的分离 用异氟醚将小鼠麻醉，再将其颈椎脱位。取出心脏并除去前室，活瓣，右心室及乳头肌等。立即称重并将左心室放入1.5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中。用剪刀将左心室剪碎。混合物再被转移到较大试管中，加入10倍体积的NaOH溶液。4 ℃下静置24 h后高速离心20 min （10000 r/min）。除去上层清液，胶原蛋白沉淀放入10倍体积的0.1 mol/L NaOH溶液中。再次在4 ℃下静置24 h后离心分离，胶原蛋白转移至2 mL试管中，加入1 mL 水振荡清洗再离心分离。用水清洗3次后，纯化的胶原蛋白储存在－20 ℃。

2.2.2 硼氢化还原胶原蛋白 将1%样品重量的NaBH4溶解于0.1 mmol/L NaOH溶液中，再加入样品，室温放置3 h并不时振荡， 加入冰醋酸至pH＝2。在4 ℃下离心分离，除去上层清液。加入1 mL水清洗。重复2次用水清洗。样品用真空离心蒸发浓缩器蒸干。

2.2.3 酸水解胶原蛋白 将1 mL 6 mol/L HCl加入5 mg样品中。将混合物放入110 ℃烤箱内20 h。然后将样品蒸干储存在－20 ℃冰箱中。

2.2.4 低能碰撞诱导解离（CID） 实验使用Applied Biosystem Q-trap 4000型质谱仪 （Foster City, CA），装配纳流喷雾电离源，使用正离子模式。PYD和DPD标准样用甲醇-水混合物（70∶30, V/V）稀释10倍。在胶原蛋白水解产物中加入200 L甲醇-水混合物（70∶30, V/V），充分振荡后，离心分离，取上层清液用作分析。质谱仪优化后的参数为： 进样流速为2.0 L/min。碰撞气体为氮气，碰撞能量为25～45 eV。碰撞室的压力维持在1 Pa左右。裂解实验中选择单一同位素前体离子以去除其它同位素峰的干扰。

3 结果与讨论

3.1 PYD和DPD的子离子扫描谱（Product Ion Spectra）

PYD和DPD具有类似的化学结构 （图1），它们的分子离子峰分别出现在m/z 429和413。图2a是PYD的MS/MS谱。分子离子峰位于m/z 429。分子离子活化后，可观察到几条裂解途径。首先， 图1 吡啶诺林（PYD）和去氧吡啶诺林（DPD）的化学结构，自然状态以阳离子形式存在。唯一区别是R3支链上的OH和H

Fig．1 Chemical structures of pyridinoline （PYD） and deoxypyridinoline （DPD）, which naturally exist as cations. The only difference is between OH and H in R3

通过中性丢失氨（17 Da）产生m/z 412的碎片离子。分裂掉N-烷基化的R3侧链形成m/z 267的碎片离子，进一步失水产生m/z 249的离子。位于m/z 146的碎片峰是R3＋离子，而m/z 128的离子是R3＋失水的产物，m/z 100是R3＋中性丢失HCOOH（46 Da）的结果，同理m/z 82是R3＋中性丢失\产生的。

DPD的MS/MS谱如图2b所示，分子离子峰位于m/z 413。DPD经历类似于PYD的裂解途径。中性丢失氨产生m/z 396的碎片离子。这里同样产生了R3＋离子（m/z 130），再丢失HCOOH产生m/z 84的产物离子。特别值得注意的是，DPD同样分裂掉N-烷基化的R3侧链并失水，分别产生了m/z 267和249离子，这一特征与PYD相同。比较PYD和DPD的子离子扫描谱，不难看出它们具有类似的裂解途径。DPD的裂解途径相对简单，因为DPD的R3侧链比PYD的R3侧链少一个羟基（图1），因而DPD的失水途径大大减少。

图2 （a） 吡啶诺林（PYD）和（b）去氧吡啶诺林（DPD）的子离子扫描谱。碰撞气体为氮气，碰撞能量为45 eV

Fig．2 Product ion spectra of （a） PYD and （b） DPD. N2 was used as collision gas, and the collision energy was 45 eV

3.2 PYD和DPD的母离子扫描谱 （Precursor ion scanning）

三重四极杆质谱仪（QqQ）（或Q-trap）的前体离子扫描模式是从复杂混合物中识别目标分子的有力工具。前体离子扫描模式固定Q3的DC和RF，使得只有某一特定m/z值的离子被检测到。通过扫描Q1使一定范围的m/z离子得以通过Q1，到达碰撞室（q），发生裂解。最终只有能够产生某一特定碎片离子的前体离子会出现在谱图上。本实验中胶原蛋白的水解产物是包含各种氨基酸和交联氨基酸及其它杂质的混合物。要通过色谱或其他技术提纯PYD或DPD几乎是不可能的或非常困难。所以，前体离子扫描非常适合用于检测该复杂体系中的PYD或DPD。 图3 PYD和DPD混合标准样的母离子扫描谱。扫描Q1使全部离子（m/z 200～500）通过，Q3固定在m/z 267。碰撞气体为氮气，碰撞能量为45 eV

Fig．3 Precursor ion scan MS/MS spectrum of PYD and DPD standard mixture. Q1 was scanning to transmit all the ions （m/z 200－500） formed at the Nanospray source, and Q3 was fixed at m/z 267. N2 was used as the collision gas, and the collision energy was 45 eV

PYD和DPD的裂解行为近似，更重要的是它们都产生m/z 267的碎片离子。该离子峰可用作指纹特征峰，同时由于该碎片是通过开环反应产生的，因而比脱水或脱氨的中性丢失更具独特性。此外，选择该峰的另一优势在于可以同时检测PYD和DPD。PYD和DPD标准样品的母离子扫描谱如图3所示，只有两个主峰出现，m/z 429和413，分别对应PYD和DPD，显示了m/z 267的前体扫描具备高选择性，其它杂质的干扰很少。但是，谱图上仍然可见一些低强度前体离子，如m/z 438和388，这说明当该扫描应用到胶原蛋白水解产物时，杂质影响不可避免，因为PYD和DPD的浓度不会很高且样品组分非常复杂。

为了找到PYD和DPD最佳的指纹特征片段，选择PYD和DPD最小的裂解片段，分别为m/z 82和84 （图2）。选择这两个峰的原因是由于它们是赖氨酸或羟赖氨酸残基的一部分（图1），因而除PYD和DPD外，其它交联氨基酸也有可能产生m/z 82或84的残片，所以它们有可能成为识别其他交联氨基酸的特征峰。图4是PYD和DPD标准样混合物的m/z 84和82的母离子扫描谱。在m/z 84的母离子扫描谱（图4a）中可看到很强的m/z 413峰，说明m/z 84的主要贡献来自于DPD；还出现一组低质量峰及m/z 429弱峰，这说明其选择性不高。同样，m/z 82的前体扫描也有类似问题（图4b），除了最强的m/z 429（PYD）外，还有其它信号出现。至此说明选择m/z 267作前体扫描的选择性要大大高于选择m/z 84或82，原因可能是小质量离子有更多途径生成，而且产生小质量离子的概率也高于大质量离子。综合图3和图4的结果，表明m/z 267是识别DPD和PYD的最佳选择。

图4 PYD和DPD混合标准样的母离子扫描谱

Fig．4 The precursor ion scan MS/MS spectra of PYD and DPD standard mixture

a. Q3固定在m/z 84； b. Q3固定在m/z 82。碰撞气体为氮气，碰撞能量为45 eV。 a. Q3 was fixed at m/z 84; b. Q3 was fixed at m/z 82. N2 was used as the collision gas, and the collision energy was 45 eV

3.3 小鼠心室胶原蛋白水解产物的全扫描和母离子扫描谱

水解的胶原蛋白含有自由氨基酸和交联氨基酸以及可能的其它杂质，其全扫描质谱如图5a所示。由于成分非常复杂，图谱背景信号很强，因而期待的m/z 413和429的峰难以从中辨认。m/z 175峰符合精氨酸分子离子的质量，对比文献\，m/z 175的MS/MS谱符合精氨酸的特征（图5b），这可证明所测样品确是水解的蛋白质，说明蛋白质的提取这一精细操作是成功的。

图5 （a） 小鼠心室胶原蛋白水解产物的全扫描质谱。（b） 图5a中m/z 175离子的子离子扫描谱。碰撞气体为氮气，碰撞能量为25 eV

Fig．5 （a） Full scan MS spectrum of hydrolyzed mouse ventricle collagen; （b） product ion spectrum of the peak at m/z 175 in Fig.5a. N2 was used as the collision gas, and the collision energy was 25 eV

图6a为小鼠心室胶原蛋白水解产物的母离子扫描（m/z 267）。虽然背景信号比PYD和DPD的标

图6 （a） 小鼠心室胶原蛋白水解产物 （b） 溶剂的母离子扫描谱。Q3固定在m/z 167。碰撞气体为氮气，碰撞能量为45 eV

Fig．6 The precursor ion scan MS/MS spectrum of hydrolyzed mouse ventricle collagen（a） ; solvent（b）. Q3 was fixed at m/z 267. N2 was used as the collision gas, and the collision energy was 45 eV

准样（图3）强很多，但对应于DPD的m/z 413信号依然可见。同时PYD的信号未检测到。文献\表

明，PYD几乎只在骨胶原蛋白中存在，此结果与本研究一致。谱图中除m/z 413外，还有许多其它峰，但m/z 413的信号是最强的。尽管如此，由于信号绝对强度不高（～3200 cps），因而可能怀疑该信号为噪音。本实验在不同时间（天）重复多次，均获得相同结果。此外，测试了甲醇-水（70∶30，V/V）溶剂的前体扫描（m/z 267）作为空白实验（图6b），未发现m/z 413的信号，更重要的是信号强度最大约300 cps，远小于实际样品。对比图6a和图6b，可以确认DPD存在于心脏胶原蛋白，并且是其交联的方式之一。

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4 结 论

研究了两种重要的交联氨基酸吡啶诺林（PYD）和去氧吡啶诺林（DPD）的质谱裂解特征。基于PYD和DPD的裂解途径，m/z 267被选作识别PYD和DPD指纹特征峰。m/z 267前体扫描具有对PYD和DPD的高度选择性。从小鼠心室胶原蛋白水解产物中检测到了DPD，未检测到PYD，说明PYD与心脏胶原蛋白的交联过程无关。而DPD在心脏胶原蛋白交联中起更重要的作用， 因此，有可能成为心脏衰竭相关的分子标记。本研究采用的质谱研究心脏胶原蛋白交联产物的方法，也可用于分析其它胶原蛋白的交联产物。

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Mass Spectrometric Analysis of Cross-linked Amino Acids in Collagen

JIANG Wei*1, YU Gang2

（1Novartis Institutes for Biomedical Research, Cambridge, MA 02139 USA, 2Department of Earth and

Planetary Sciences, Harvard University, Cambridge, MA 02138 USA）

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Abstract Cross-linking plays a critical role in determining the mechanical strength of heart collagen, and its malfunction is probably related to the occurrence of heart failure. Studies show that the content of some cross-linked amino acids can be used as biomarkers for the abnormal cross-linking of their corresponding collagens. However, it is still unclear about the biomarkers for the unusual cross-linking in heart collagen. Hence we present a tandem mass spectrometry method that enables highly selective identification of two important crosslink, amino acids-pyridinoline （PYD） and deoxypyridi-noline （DPD） in hydrolyzed collagen. DPD is detected in acid hydrolyzed mouse ventricle collagen, while PYD not, indicating that PYD is not related to the cross-linking processes in heart collagen, but DPD plays a more significant role, so DPD might become a biomarker for heart failure. Overall, this study provides a mass spectrometry based method to investigate the cross-linking products in mouse heart collagen, which can be also applied to other collagens

Keywords Heart failure; Collagen; Cross-linked amino acid; Mass spectrometry; Precursor ion scan

（Received 28 June 2011; accepted 2 September 2011）