商品鸭H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断

材料与方法

1.1 病料

采自病死鸭的心、肝、脑、脾、肺和气管等组织。

1.2 试剂

常规培养基，购自北京路桥技术有限责任公司；犊牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司；TSB，购自BD公司；High Pure Viral RNA Kit Version 18，购自Roche 公司；Prime Script One Step RTPCR Kit Version 2试剂盒，购自TaKaRa公司；引物由华大基因公司合成。药敏纸片按照CLSI标准自制。

1.3 细菌学检测

1.3.1 细菌的分离培养与形态学观察。

无菌挑取病死鸭的心、肝、脑和脾等组织，分别划线接种于TSA平板、SS琼脂平板、麦康凯琼脂平板和普通琼脂平板上，其中TSA平板进行烛缸培养，将所有平板置于37 ℃下培养24 h观察。根据各种平板上细菌的生长情况，挑取单菌落进行纯化、革兰染色和瑞氏染色，观察细菌形态。

1.3.2 鸭疫里默氏杆菌的PCR鉴定。

为了进一步鉴定分离到的细菌是否为鸭疫里默氏杆菌，利用实验室已建立的针对鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白基因的特异性PCR方法进行验证[5]，上游引物为5′TGGAGCCAACTATTTGAGAC3′；下游引物为5′CCTTTAATGCTCCTGTTGCT3′，预期扩增片段的长度为660 bp，PCR产物经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检验后送交擎科生物公司测序。

1.3.3 药敏试验。

将浓度调整为108 CFU/mL的新鲜鸭疫里默氏杆菌菌液涂布TSA平板，放置5 min后，按照常规方法将氟苯尼考和头孢噻肟等21种临床常用抗生素药敏纸片贴于平板表面，37 ℃下作用20 h后观察结果。按照CLSI标准，进行药物敏感性评价。

1.4 H5亚型和H9亚型禽流感病毒的RTPCR检测

1.4.1 引物的选择。

结合临床症状与病理变化，对流感病毒进行检测，根据文献[6-7]分别合成H5亚型和H9亚型禽流感病毒的特异性引物，H5f：5′ACCCAGCCAATGACCTCT3′，H5r：5′CACTTTGCCCGTTTACTT3′；H9f：5′ CAACAAACTCCACAGAAACT 3′，H9r：

5′ ATCTGAACATGCTTTGCTTTG 3′。 H5亚型和H9亚型禽流感病毒的预期扩增片段长度分别为420和380 bp。

1.4.2 RNA提取。

无菌取病死鸭肺脏和气管，剪碎，按1∶5的比例加入灭菌PBS匀浆，将匀浆液反复冻融2次，12 000 r/min 离心20 min，抽取上层清亮液体，用0.22 μm 滤器过滤除菌，取滤液按照High Pure Viral RNA Kit说明书要求提取病毒RNA。

1.4.3 RTPCR扩增及其产物检测。

使用一步法RTPCR 试剂盒（PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2）扩增H5亚型和H9亚型禽流感病毒基因片段。采用25 μL 反应体系：上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，RNA模板5 μL，超纯水4.5 μL，PrimeScript One Step Buffer 12.5 μL，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1 μL，混匀后置于PCR 仪中进行PCR扩增。PCR扩增程序为：50 ℃反转录45 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；最后72 ℃终延伸5 min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳观察，将PCR产物送交擎科生物公司测序。

2 结果与分析

2.1 细菌学检测结果

2.1.1 细菌的分离培养与形态学观察。

普通培养基、麦康凯培养基和SS培养基上均没有细菌生长，肝组织在TSA平板上长出无色透明菌落，菌落呈圆形，表面光滑、隆起，边缘整齐，斜对光观察有蓝光。经过革兰染色镜检可见阴性小短杆状细菌；经过瑞氏染色镜检可见两极着色。

2.1.2 鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白基因片段的PCR鉴定结果。

对鸭疫里默氏杆菌的外膜蛋白基因片段进行PCR扩增，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳对其PCR产物进行观察，在660 bp处得到1条明亮的条带（图1），与预期片段大小相同，对测序结果进行BLAST比对，确定分离菌为鸭疫里默氏杆菌。

2.2 鸭疫里默氏杆菌的药敏试验结果 根据CLSI标准，判定RA对所用抗生素的敏感程度。由表1可知，分离到的鸭疫里默氏杆菌对大多数临床常用抗生素耐药，仅对多西环素、头孢他啶、环丙沙星和诺氟沙星等喹诺酮类药物敏感。

2.3 病毒学检测结果

RTPCR扩增H5亚型和H9亚型禽流感病毒，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳观察，H5亚型禽流感病毒没有扩增到目的条带，在380 bp处得到1条明亮的条带（图2），与H9亚型禽流感病毒预期目的条带大小相同，测序结果经Blast比对与H9亚型禽流感病毒的同源性达100%，因此确定该批鸭受 H9亚型禽流感病毒的感染。通过细菌学和病毒学检测，可诊断为该批病死鸭为鸭疫里默氏杆菌和H9亚型禽流感病毒混合感染。

3 讨论与结论

鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌是临床最常见的感染鸭的细菌性病原体。大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌感染鸭均可引起纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎，易于混淆。其中，鸭疫里默氏杆菌对营养条件要求较高，一般在普通培养基、麦康凯培养基和SS培养基上不能生长，而在添加小牛血清的TSA培养基上生长良好。大肠杆菌和沙门氏菌对营养要求不高，大肠杆菌在麦康凯培养基上形成红色菌落，绝大多数沙门氏菌因产生硫化氢在SS培养基上会形成黑色菌落，因此可根据菌株在不同培养基上的生长特性不同进行初步鉴定。近年来，随着抗菌药在畜牧养殖领域中的广泛、大量甚至盲目使用，细菌的耐药性问题越来越严重。很多国家及地区相继报道出现了对多种抗菌药物耐药的鸭疫里默氏杆菌菌株[8-9]。笔者分离到的鸭疫里默氏杆菌也表现出对大多数常用抗菌药的耐药性。这要求在临床用药选择上应根据药敏试验有针对性地选择，并按照联合、轮换、交叉用药原则进行药物配伍。

目前，绝大多数养鸭场都会进行H5亚型和H9亚型禽流感的免疫预防，但由于流感病毒易变异，当流行株和疫苗株不一致时，免疫鸭仍然存在感染的风险。该试验中检测到的H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌的混合感染并非个例，由于饲养管理不到位和环境卫生条件差所导致的多病原混合感染非常普遍。据报道，H9亚型禽流感病毒与大肠杆菌、传染性支气管炎病毒等其他病原体混合感染的协同作用是导致目前H9亚型禽流感流行的主要原因[10]。鸭疫里默氏杆菌出现与多种病原体混合感染的现象，与鸭疫里默氏杆菌混合感染的细菌种类有大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌[11-13]；与鸭疫里默氏杆菌混合感染的真菌种类有黄曲霉菌[14]；与鸭疫里默氏杆菌混合感染的病毒有鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、新城疫病毒以及法氏囊病毒[15-16]；鸭疫里默氏杆菌还可以与球虫等寄生虫混合感染。混合感染的现象给临床诊断带来很大的困难，容易造成误诊或只判断出某一病原，导致治疗不及时，造成巨大的经济损失。其中，鸭疫里默氏杆菌在商品肉鸭上的感染近几年也出现了新的流行特点，不再集中于低日龄鸭的感染，临近出栏的鸭子也开始频频发病，这给肉鸭养殖造成的经济损失更大。为了预防病毒与细菌等多病原混合感染，养殖场首先应注意加强饲养管理和环境卫生工作，建立良好的生物安全措施；其次，对病毒病的预防除了根据本地区疾病的流行情况制订合理的免疫程序外，还应注意所选用疫苗或卵黄抗体与流行毒株的一致性。

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