响应曲面法优化雷公藤农药用总生物碱的闪式双水相提取工艺

摘要：以雷公藤总生物碱提取率为指标，采用乙醇-硫酸铵闪式双水相提取法对总生物碱提取工艺进行单因素及Box-Behnken响应曲面试验优化。结果表明，雷公藤总生物碱闪式双水相提取的最佳工艺条件为提取时间126 s、（NH4）2SO4用量0.41 g/mL、液料比24 mL ∶1 g、pH值3，此条件下得到的雷公藤总生物碱提取率为（19.01±008）%。该工艺科学、合理、可行，为杀虫活性物质雷公藤生物碱的产业化开发奠定了基础。

关键词：雷公藤；总生物碱；闪式提取；双水相；Box-Behnken响应曲面试验

中图分类号： TQ453.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0187-04

收稿日期：2017-03-29

基金项目：贵州省大学生创新创业项目（编号：201514440014）；贵州省教育厅教学改革项目（编号：2015QNXM08）。

作者简介：李 安（1989—），女，重庆人，硕士，讲师，主要从事天然产物开发及保健食品研究。E-mail：20140517@git.edu.cn。

通信作者：吴德智，博士，副教授，主要从事食品与药品研究开发。E-mail：47722068@qq.com。 雷公藤系卫矛科（Celastracese）雷公藤属植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）的根，在我国资源丰富，具有较好的药用和农用价值。其活性成分主要是二萜内酯类、生物碱类及三萜类化合物等，具有抗菌、抗炎、免疫调节等多种药理作用，可治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，临床应用广泛[1-2]。我国民间常利用雷公藤防治各种害虫，其主要杀虫成分为雷公藤总生物碱，对多种害虫具有较强的胃毒、拒食、麻痹、触杀和生长发育抑制等作用[3-8]。因此，雷公藤作为一种杀虫植物具有较大的研究开发潜力。

闪式提取法作为一种新的提取方法，利用适当溶剂在数秒至几分钟内将物料快速破碎至适当粒度，通过高速搅拌、超强振动、负压渗滤等功能实现提取[9]。闪式提取法具有操作清洗简单、维护方便的特点，且较短的提取时间使得能耗减少，降低了生产成本。目前闪式提取法的研究已涉及中药、食品、农副产品等领域，具有快速、高效、节能、环保等特点[10-11]，结合双水相提取，有更好的分离性能，且有利于醇类的回收[12-13]。因此，本研究以雷公藤总生物碱提取率为指标，通过单因素和Box-Behnken响应曲面试验优化闪式双水相提取工艺条件，对雷公藤农药的研究及开发具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雷公藤药材，购自福建汉堂生物制药股份有限公司；正己烷、无水乙醇等试剂均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；雷公藤吉碱（自制，纯度大于98%），用面积归一法制得；甲醇（色谱纯），购自美国天地有限公司。

1.2 仪器与设备

JHBE-50T闪式提取器，购自河南金鼎科技发展有限公司；FA1004B电子天平，购自上海越平科学仪器有限公司；UV-2550 型紫外-可见分光光度计，购自梅特勒-托利多（中国）；HH-1智能数显电热恒温水浴锅，购自杭州大卫科教仪器有限公司；旋转蒸发器，购自上海上天精密仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 双水相体系的确定及闪式双水相提取雷公藤总生物碱工艺 准确称取100 g雷公藤根皮粉末（粉碎过100目筛），按试验要求加入适量的乙醇-硫酸铵双水相体系溶液，闪式提取。取上清液于60 ℃真空旋转蒸发回收溶剂，所得浓缩液真空干燥，得雷公藤总生物碱提取物。由前期预试验可知，当乙醇体积分数为40%、（NH4）2SO4用量为0.2～0.5 g/mL 时可以形成较稳定的双水相体系。因此，本试验固定乙醇的体积分数为40%，进行其他工艺参数的考察。

1.3.2 雷公藤总生物碱含量的测定[14]

1.3.2.1 标准曲线的绘制 精确称取适量雷公藤吉碱，加甲醇配制成浓度为304 μg/mL的对照品储备液。精确量取10、15、2.0、2.5、3.0、3.5 mL雷公藤吉碱对照品储备液置于 10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，在268 nm波长处测定其吸光度，得出以吸光度（D268 nm）为纵坐标、以雷公藤吉碱的浓度（x）为横坐标的标准回归方程为D268 nm=0.005 8x-0.008 73，r=0.999 2。雷公藤吉碱的浓度在 30.4～103.2 μg/mL 范围内线性关系良好。

1.3.2.2 供试品溶液的测定 取雷公藤生物碱提取物，用30 mL、0.5 mol/L HCl溶液提取3次，合并酸液，用30 mL三氯甲烷萃取酸水液2次，弃去三氯甲烷层，在酸水中加入浓氨水调节pH值约为7，静置，用滤纸过滤，加浓氨水调节pH值为9～11，再用90 mL三氯甲烷分3次萃取至水中无生物碱为止，合并三氯甲烷液，在旋转蒸发仪中浓缩至干，加入5%HCl溶液并定容至 25 mL，即得雷公藤總生物碱供试品溶液。

1.3.2.3 生物碱提取率的计算 于紫外分光光度计上测定各提取物溶液在268 nm处的吸光度，根据线性方程得到总生物碱含量，并按下列公式计算雷公藤药材中总生物碱的提取率：

总生物碱提取率=总生物碱含量（mg/L）×25 mL根皮粉质量（mg）×1 000×100%。

1.3.3 单因素考察闪式双水相提取工艺[9-10] 本试验针对提取时间（60、90、120、150、180 s）、（NH4）2SO4用量（0.2、03、0.4、0.5、0.6 g/mL）、液料比（12 mL ∶1 g、16 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、24 mL ∶1 g、28 mL ∶1 g）、pH值（1、2、3、4、5）4个因素，保持其中3个变量固定不变，对另一个变量进行单因素试验，以雷公藤总生物碱提取率为指标，确定Box-Behnken响应曲面设计所需的水平范围。试验设计如表1所示。

1.3.4 Box-Behnken响应曲面法优选提取工艺 在单因素试验的基础上，选取提取时间、（NH4）2SO4用量、液料比、pH值对雷公藤总生物碱提取率影响较大的因素，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken试验，以总生物碱提取率为指标优化提取工艺参数。

2 结果与分析

2.1 单因素考察闪式双水相提取工艺

2.1.1 提取时间对雷公藤总生物碱提取率的影响 由图1可知，随着提取时间的增加，雷公藤总生物碱提取率呈先上升再稳定后下降的趋势。当提取时间为120～150 s时，总生物碱提取率稳定在17.3%左右，当继续增加提取时间，提取率反而出现下降。可能是由于闪提过程中刀头剪切作用产生的热随时间延长使溶液温度升高，导致生物碱类结构遭到破坏而使总生物碱提取率降低。因此，选择提取时间为90、120、150 s进行后续的Box-Behnken响应曲面试验。

2.1.2 （NH4）2SO4用量对雷公藤总生物碱提取率的影响 由图2可知，随着（NH4）2SO4用量的增加，雷公藤总生物碱提取率呈现先上升后下降的趋势。当（NH4）2SO4用量为 0.4 g/mL 时，总生物碱提取率最高，为16.5%。当继续增加（NH4）2SO4用量时，可能破坏了双水相体系，使得平衡遭到破坏，从而影响提取效率。因此，选择（NH4）2SO4用量为03、0.4、0.5 g/mL进行后续的Box-Behnken响应曲面试验。

2.1.3 液料比对雷公藤总生物碱提取率的影响 由图3可知，随着液料比的增加，雷公藤总生物碱提取率先上升后稳定。当液料比大于24 mL ∶1 g时，总生物碱提取率稳定在17.2%左右。因此，选择液料比为20 mL ∶1 g、24 mL ∶1 g、28 mL ∶1 g 进行后续的Box-Behnken响应曲面试验。

2.1.4 pH值对雷公藤总生物碱提取率的影响 由图4可知，随着pH值的增加，雷公藤总生物碱提取率先上升后下降。当pH值为3时，总生物碱提取率最高，为16.9%，主要是由于生物碱在酸性条件下易于溶出。因此，选择pH值为2、3、4进行后续的Box-Behnken响应曲面试验。

2.2 Box-Behnken响应曲面设计优化雷公藤总生物碱闪式双水相提取工艺

在单因素试验的基础上，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken试验，以总生物碱提取率为指标优化提取工艺参数，试验结果如表2所示。

采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken试验，对各因素进行拟合，得到多元回归方程为R提取率=-109.012 5+0.466 8A+47.866 7B+5.053 3C+17406 7D+0.075 0AB-2.708 3×10-3AC+1.666 7×10-3AD+1.187 5BC -0.750 0BD -0.075 0CD-1.738 9×10-3A2-102.750 0B2-0.102 5C2-2427 5D2。

对雷公藤总生物碱提取率的回归模型进行方差及显著性分析，结果如表3所示，该模型方程有显著性影响（P<0.000 1），失拟项不显著（P=0.423 2>0.05），说明在本试验条件下，该回归模型所考察的因素足以反映试验中各提取工艺参数对总生物碱提取率的影响。判定系数R2=0986 4，R2adj=0.972 8，说明回归模型与试验值拟合均较好，可用于雷公藤总生物碱提取率的理论推测和分析，各因素影响力的大小表现为pH值>提取时间>液料比>（NH4）2SO4用量。由F检验可知，一次项中提取时间、液料比和pH值对总生物碱提取率具有极显著影响（P<0.01）；交互项中（NH4）2SO4用量与液料比之间的交互作用对总生物碱提取率具有极显著影响（P<0.01），提取时间与液料比、液料比与pH值之间的交互作用对提取率具有显著影响（P<0.05）；在二次项中提取时间、（NH4）2SO4用量、液料比和pH值对总生物碱提取率均具有极显著影响（P<001）；其他因素影响不显著。这一结果与图5中3D响应面图反映的各因素间交互作用的影响结果相吻合。

由Design-Expert 8.0.6软件得出雷公藤总生物碱闪式双水相提取的最佳工艺参数为提取时间125.69 s、（NH4）2SO4用量 0.41 g/mL、液料比24.18 mL ∶1 g、pH值319，雷公藤总生物碱提取率的预测值为18.93%。为便于生产试验需求，选择提取时间为126 s、（NH4）2SO4用量为041 g/mL、液料比为24 mL ∶1 g、pH值为3进行验证试验，得出的雷公藤总生物碱提取率为（19.01±0.08）%，该值与预测值相近。因此，选取此条件为雷公藤总生物碱闪式双水相提取的最佳工艺。

3 结论

響应面法已广泛应用于化工、医药、食品、农林、冶金等各领域，具有试验次数少、设计简便等优点。雷公藤及其近缘种和同科的其他植物早已有用于防治蔬菜害虫的记载，其生物碱杀虫谱广，对多种害虫有效，且作用方式復杂，药效比较快，具有化学农药速效的特点，而没有化学农药的缺点。本研究以具有广谱杀虫作用的雷公藤为主要原料，采用Box-Behnken响应曲面设计对其生物碱闪式双水相提取工艺条件进行优化。结果表明，雷公藤总生物碱提取的最佳工艺条件为提取时间 126 s、（NH4）2SO4用量0.41 g/mL、液料比 24 mL ∶1 g、pH值3，此条件下总生物碱提取率为（19.01±0.08）%，该提取工艺稳定可行，提取率高，可为雷公藤总生物碱农用杀虫的应用提供依据。

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