连作西洋参根际真菌群落差异及其在土壤药剂处理后的初步分析

材料与方法

1.1 试验地基本情况 实验于2008年在北京市怀柔区杨宋镇解村西洋参种植基地进行。整个实验地搭建高2 m的苇帘双透棚，透光率15%～20%左右。

1.2 试验设计及土壤处理 田间小区试验设5个处理，CK未种过西洋参的土壤；A1 种植过一茬西洋参（4年）的老参地土壤；A2 在A1上进行处理：碳素肥1.0 kg·m^-2+菌线威1 g·m^-2 （北京中农天诺科技发展有限公司）；B1 西洋参育苗2茬（2×2年）老参地土壤；B2 在B1上进行处理：碳素肥1.0 kg·m^-2+清源保15 mL·m^-2（北京清源保生物科技有限公司）。杀菌剂按使用说明施入土壤，与土壤充分混和。按栽培整地要求，将不同处理的土壤平铺到新地上，厚度为20 cm，南北向作高畦，畦长30 m，宽1.6 m，高0.25 m。所有处理组的土壤均为北京怀柔区杨宋镇赵各庄同一块西洋参种植地的土壤，将其运送到相距4 km的谢村新开辟的西洋参种植地。两地土壤的类型相同，0～15cm深土层理化性质相近（表1）。于4月初播种，行距为10 cm，株距为2.5 cm，床面均匀覆盖稻草2～3 cm，每个处理3次重复，小区面积10 m²，随机区组排列。

1.3 西洋参存苗，根生长及根病情况调查 2008年8月，即播种后约4个月调查存苗数，每小区随机选1 m²调查存苗数。每个处理组的数据为3个小区调查的平均数。于2008年10月各小区随机调查20 株根的重量及根病情况^[5]。根腐病分级标准：0级，根完好、无病；1级，根部发病面积占根表面积的1/3以下；2级，根部发病面积占根表面积的1/3～2/3；3级，根部发病面积占根表面积的2/3以上。

1.4 根际土壤样品的采集 于7月下旬西洋参发病高峰期采集根际土壤样品。除去表层2 cm土，以五点法取西洋参根际1～2 cm土样，混匀后作为1份土壤样品（200 g左右）。每种处理采集3份土壤样品作为重复。采集后的土壤样品于-4 ℃冰箱中保存，1周之内进行真菌分离。

1.5 土壤样品中真菌的分离培养 取10 g土壤，加入含90 mL无菌水和20颗无菌玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上，130 r·min^-1，室温震荡20 min，静置5 min，上清液即为稀释10倍的土壤悬液。依次梯度稀释后，选择稀释1 000倍的浓度，取1 mL悬液，加至培养皿中，倒入50 ℃马丁氏培养基（加氯霉素100×10^-6），水平混合均匀，冷却后封口，放置25 ℃培养箱中培养，每个样品重复4皿。7 d后对长出的菌落进行计数并单孢分离。

1.6 形态学鉴定 根据菌株在马铃薯培养基（PDA）上的菌落性状以及分生孢子、分生孢子梗、产孢方式等微观特征，参考Carmichael等^[7]和 Domsch等^[8]的著作进行鉴定。

采用双变量分析比较存苗数、根重及根病指数与根际真菌多样性指数之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 不同处理对西洋参生长及根病的影响 新地（CK）与直播地（A1）间存苗数无显著差异（图1），而育苗2茬参地（B1）存苗数显著降低（F=8.006，P=0.004）。不同土壤消毒剂的处理效果不同，碳素肥加菌线威处理的土壤（A2），存苗数较A1提高，甚至略高于新地（CK）水平；碳素肥加清源保消毒处理的土壤（B2），存苗数低于不处理的B1。对根重及根病指数的调查结果显示，2种老参地土壤（A1，B1）连作西洋参根重均显著低于新土栽培（F=15.661，df=2，P=0.004），且根病指数显著升高（F=14.384，df=2，P=0.005）。碳素肥加菌线威处理（A2）后，比不处理（A1）根重增加29.3%，根病指数降低10.4%，但差异不显著（t=1.537，P=0.199）。碳素肥加清源保处理后（B2）根重及根病指数与不处理（B1）相比无显著变化（t=1.720，P=0.161）。

2.2 连作及土壤消毒处理下西洋参根际真菌群落的变化 从所有土壤样品中共分离到13属真菌，其中从新土（CK）中分离的真菌种类和数量最多，共11个属，真菌总数为2 000 CFU·g^-1。从其他处理组分离到的真菌总数分别为750 CFU·g^-1（A1），1750 CFU·g^-1（A2），1 000 CFU·g^-1（B1），1 500 CFU·g^-1（B2）。在所有土壤样品中，木霉属Trichoderma为主要优势类群，各处理组的分离频率分别为29%，33%，50%，33%，50%（表2）。

与新地（CK）相比，老参地（A1，B1）种植西洋参根际的真菌种类减少，真菌群落构成发生显著变化（表2）（F=4.932，P=0.012），真菌的群落多样性指数降低（表3）。在直播地（A1）中青霉属Penicillium，曲霉属Aspergillus及镰刀菌属Fusarium的比例增大，由新地中的7%，4%，4%分别增加至22%，33%，11%；在育苗地（B1）中青霉属Penicillium及曲霉属Aspergillus的比例也增高，分别为17%，42%。直播地及育苗地二者间的真菌群落构成无显著性差异（表2）。不同的碳素肥及消毒剂复合处理后，根际土壤的真菌多样性有不同程度的提高（表3），但差异不显著。特别值得注意的是木霉属Trichoderma的数量都有较大提高（表2）。总的来说根际土壤真菌的多样性指数（H′，M_a以及J）与西洋参根病指数呈显著负相关（r=-0.970，P=0.006）。

3 小结与讨论

对西洋参生长参数的调查发现，种植过4年西洋参的老参地与新地相比，连作西洋参的存苗数、根重均显著降低，根病指数升高，其中育苗2茬后的老参地西洋参长势更差，推测是由于育苗地西洋参密度较大，造成的土壤问题更为严重。张梦昌等^[3]报道老参地连作人参，细菌、放线菌、真菌的数量下降，土壤中真菌以青霉属和曲霉属为主。本研究发现，与新土相比，老参地土壤在西洋参发病高峰期，根际真菌数量和多样性降低，群落构成发生变化。其中真菌数量的变化规律与前人报道的一致。新的发现在于连作导致西洋参根际土壤真菌的多样性指数显著降低，主要是由于真菌种类减少造成的，而其中青霉属、曲霉属等少数真菌数量则明显增加。相关性分析结果发现真菌的多样性指数与西洋参根病指数具有较高的负相关性，即根际真菌的多样性指数越低，西洋参根病发生程度越严重。一般认为，微生物多样性越高的土壤对病原菌的自然拮抗作用越强，病害的发生率越小^[11-12]，作者的研究结果也证实了这一点。可以考虑将真菌的多样性指数及群落构成特点作为栽参地土壤状态评价的一个重要指标。

土壤消毒是克服作物土传病害最有效的途径之一，特别是在农业机械化程度较高的国家和地区，许多经济作物栽培前进行土壤处理已经成为常规的技术措施^[5]。本课题组前期发现老参地用农药进行土壤消毒或添加紫苏根粉对减轻西洋参连作病害、促进根的生长有一定的作用^{[2， 5-6]}。在北京地区西洋参生产中碳素肥被广泛用于西洋参播种前加入土壤以增加土壤肥力，本实验分析了碳素肥加低毒化学农药菌线威及碳素肥加植物源农药清源保处理对连作西洋参生长及减轻病害方面的作用，同时还研究了这些处理下根际真菌类群的变化情况，从而探讨碳素肥加消毒剂处理对非病原真菌的影响。菌线威的主要成分为二硫氰基甲烷，具有极高的杀菌杀线虫活性，清源保的主要成分为苦参碱。其中，碳素肥加菌线威对西洋参存苗数、根重的提高及根病指数的降低有一定的作用，在生产实践中可以作为一种较好的选择。对西洋参根际真菌群落的研究结果发现，2种复合处理后，根际真菌数量和种类均提高，真菌丰富度及多样性指数均有所增加，特别是木霉属的数量和比例都提高，可能说明碳素肥加这两种消毒剂处理对非病原真菌的影响小，有助于土壤达到新的微生态平衡。由于本实验只有一个时间点的测定结果，要明确老参地土壤的退化机制及土壤处理措施对其的恢复作用尚待更多的试验证据。

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Effect of continuous cropping and soil treatment on rhizosphere fungal community of Panax quinquefolium

CHEN Juan， ZHANG Xue-song， YANG Jia-xue， JIAO Xiao-lin， GAO Wei-wei

（The Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，

Ministry of Education， Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical

Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193， China）

[Abstract] Objective： To analyze the effects of continuous cropping and soil treatment on rhizosphere fungal community of Panax quinquefolium， and the correlation between rhizosphere fungal community and growth of P. quinquefolium. Method： Field plot trail of continuous cultivated P. quinquefolium was conducted， meanwhile continuous cropping soil was treated by organic carbon fertilizer plus methylene dithiocyanate and Kingbo respectively. The rate of seedling survival， root disease index and root weight were investigated. Dilution plating was used to analyze the rhizosphere fungal community， multiple comparisons including H， M_aand J were performed between rhizosphere fungal community and growth of P. quinquefolium. Result： As to P. quinquefolium planted in continuous soil， the rate of seedling survival， root weight decreased， root disease index increased remarkably（P<0.05）. Meanwhile the fungal counts decreased 50%-63%， the diversity index （H′） decreased 39%-43%， while the ratio of Penicillium and Aspergillus increased. There was a significant negative correlation between rhizosphere fungal diversity and P. quinquefolium root disease index（r=-0.970，P=0.006）. Organic carbon fertilizer plus methylene dithiocyanate treatment could improve the rate of seedling survival and root weight， and could partly increase the rhizosphere fungal diversity. Conclusion： In continuous cropping soil of P. quinquefolium， the rhizosphere fungal counts and diversity index decreased， meanwhile the fungal community composition changed. Organic carbon fertilizer plus methylene dithiocyanate treatment could improve the growth of continuous cultivated P. quinquefolium.

[Key words] Panax quinquefolius； continuous cropping； soil treatment； fungal community； diversity index

doi：10.4268/cjcmm20122305

[责任编辑 吕冬梅]