虎杖苷转化菌的筛选及所产酶的性质研究

对照品的纯度为98%，购自西安华翠生物技术有限公司。甲醇（HPLC级）、乙醇、乙睛（HPLC级）、乙酸乙酯。

仪器：GNP-9080隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备公司）;ES-315高压蒸汽灭菌锅（TOMY，Japan）;Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent公司）;HD-930型组合式全温摇床（江苏太仓市博莱特实验仪器厂）;高速离心机Sigma 3k30（Sigma公司）。

1.2 菌种筛选与鉴定

1.2.1 虎杖苷转化菌的筛选 初筛：取虎杖粉末用无菌水冲洗，梯度稀释，按常规方法涂布，30 ℃培养2 d，挑选出长势良好的单菌落，保藏待用。复筛：将初筛菌种活化培养，制成孢子悬液，转接至复筛培养基，30 ℃、160 rpm培养，取样检测。

1.2.2 菌种鉴定 将筛选到的菌株接种到PDA培养基上，在不同时间观察菌落生长性状，待产孢后取菌丝制作临时玻片在透视显微镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子，并描述它们的形态特征;用透视显微镜观察菌丝的自然生长和分支状况。根据形态特征对菌株进行分类鉴定。

1.3 酶学性质研究

1.3.1 粗酶液的制备 将活化后的菌种斜面用无菌水制成孢子悬浮液，接种到发酵产酶培养基，28 ℃条件下静止培养48 h。取固体曲，用pH值为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浸提，固液比为1 ∶ 10，将其用尼龙纱布过滤，4 500 rpm离心15 min，上清液即为酶液。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶最适温度及稳定性 在不同温度下分别以1%水杨苷和0.05%虎杖苷为底物，按常规法测定酶活力，分别于50、55、60、65、70 ℃测定酶活力。酶液分别在30、40、50、60、70 ℃下保温12 h，测定酶活力。取酶液，放于 60 ℃ 水浴中，分别在2、4、6、8、10、12 h取样，检测酶活力。

1.3.3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸碱稳定性的影响 分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二 钠- 柠檬酸缓冲液，常规方法测定酶活力。此外，将酶液与上述不同pH值缓冲液在60 ℃下放置1 h后，按常规法测定对应的酶活力。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特异性 分别配制浓度为 0.5% 的甜菊苷、虎杖苷、水杨苷、纤维二糖、京尼平苷溶液，再以它们为底物，按常规法测定对应的酶活力。

1.3.5 不同金属离子对β-葡萄糖苷酶活力的影响 选取氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸钴为试剂，在酶反应液中分别加入上述金属离子，使其终浓度为1.0 mmol/L，于60 ℃温30 min，按常规法测定酶活力，以不加金属离子的酶活力为100%。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法

水杨苷法测定β-葡萄糖苷酶活力：于0.2 mL水杨苷溶液中加入0.2 mL酶液，混匀后60 ℃反应10 min，加入1 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂后沸水浴5 min，冷却后蒸馏水定容至10 mL，在540 nm下测定其吸光度。

酶活力单位定义：1 mL酶液在pH值5.0、60 ℃下催化反应1 min，产生1 μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 虎杖苷转化菌的篩选

通过初筛得到11株长势较好的菌种，菌株编号及转化27 h虎杖苷转化率如图1所示。初筛获得的11株菌种中，仅有H4、H6和2-6号菌有转化效果，且在转化27 h后转化率都达到了最大。其中H6号菌的转化率最高，为98%，故选取H6号菌作为虎杖苷转化菌株。

2.2 转化菌的鉴定

通过观察，菌落为绿色，背面为黄色。显微镜下观察并记录菌种的显微形态。由图2可知，显微镜下菌丝无色透明，表面光滑，有隔膜，直径为4～5 μm，菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗，分生孢子梗分枝呈扫帚状。孢子梗上着生分生孢子链，分生孢子为椭圆形，两端稍细，长5～7 μm，宽 3～4 μm。根据以上菌落形态、菌丝形状、孢子的形状及大小，初步确定为青霉属。

2.3 酶学性质研究

2.3.1 β-葡萄糖苷酶最适温度 由图3-a和图3-b可知，随着反应温度的增加，酶活力先提高后降低，在60 ℃时酶活力最高。以水杨苷为底物和以虎杖苷为底物测得的酶活力变化趋势一致。以水杨苷为底物测定酶活力能准确地反映该酶对底物的转化能力。

2.3.2 酶的稳定性影响 酶液分别在30、40、50、60、70 ℃下保温12 h，按常规法测定对应的酶活力。取酶液，放于60 ℃水浴中保藏，分别在2、4、6、8、10、12 h取样，常规方法检测酶活力。由图4可知，β-葡萄糖苷酶在50 ℃以下保温12 h后基本不失活，在60 ℃保温12 h后酶活力有损失，60 ℃以后酶活力损失较大。由图5可知，60 ℃下，1～10 h内酶活力较稳定，10 h后酶活力降幅较大。

2.3.3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性及酶的酸碱稳定性的影响 分别配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸氢二 钠- 柠檬酸缓冲液，采用常规方法测定酶活力。此外，将酶液与上述不同pH值缓冲液在60 ℃下放置1 h后，按常规法测定其对应的酶活力。由图6可知，β-葡萄糖苷酶活力随着pH值的上升先提高后降低，在pH值为5.0时酶活力最高，这与多数文献报道的一致。由图7可知，酶在pH值为4.0～6.0之间时，相对酶活力较高，保持了较高的稳定性，在pH值>6.0或pH值<4.0时，酶活力明显下降。

2.3.4 β-葡萄糖苷酶的底物特异性 在标准条件下，用 0.5% 的不同底物与酶液反应，结果如表1所示。由表1可知，酶对虎杖苷的水解效果最好，对水杨苷的水解效果其次，对纤维二糖和京尼平苷的水解效果较差，对甜菊苷的水解效果最弱。

2.3.5 不同金属离子对β-葡萄糖苷酶活力的影响 选取氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸钴为试剂。在酶反应液中分别加入上述金属离子， 使其终浓度为 1.0 mmol/L， 于60 ℃温30 min，按常规法测定对应的酶活力，以不加金属离子的酶活力为100%。从表2可以看出，金属阳离子对该酶都有不同程度的影响，其中Fe2+、Na+和Ca2+对酶活力有轻微的激活作用，而Mg2+和Co2+则有一定的抑制作用。

3 结论

本试验通过初筛和复筛得到1株霉菌，可将虎杖苷转化为白藜芦醇，经形态学鉴定为青霉菌属。对其所产酶的酶学性质进行了研究，结果表明：酶的最适pH值为5.0，pH值在4.0～6.0之间时，酶的稳定性较好;酶最适反应温度为 60 ℃，并且在该温度下具有较好的热稳定性;Fe2+、Na+和Ca2+对酶活力有激活作用;虎杖苷是该酶理想的水解作用底物。

本试验的结果可以拓展白藜芦醇的制备途径[17]，增加虎杖的利用价值。可以用虎杖中药材为原料，先提取虎杖苷，利用该菌株所产的酶液转化虎杖苷，或将酶液制成固定化酶再将虎杖苷转化成白藜芦醇。另外，还可以将虎杖药材粉碎后与该菌进行共发酵，从发酵后的固体曲中提取白藜芦醇。

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