葡萄籽衍生原花青素通过抑制MMP-9活性和相关血脑屏障损伤来减轻化疗诱导认知障碍

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　制 葡萄籽衍生的原花青素通过抑制 MMP-9 活性和相关血脑屏障损伤来减轻化疗诱导的认知障碍

　抽象 （1）背景：化疗诱导的认知障碍（CICI）经常在癌症患者中观察到，并损害他们的生活质量。葡萄籽导向的原花青素已被证明具有抗炎和神经保护作用，但其在预防 CICI 方面的作用尚未得到研究。（2）方法：成年雄性小鼠接受 2.3mg / kg 顺铂或盐水注射，共 3 个周期，包括 5 次每日注射，然后休息 5 天。原花青素或生理盐水在顺铂治疗前 1 小时给药。治疗停止后进行认知测试，明胶酶图和血脑屏障（BBB）渗透测试。用刺激的 SHSY5Y 细胞上清液处理 RAW264.7 细胞。此外，还测试了高迁移率基团蛋白 B1（HMGB1）的表达和 MMP-9 活性。（3）结果：重复顺铂治疗增加了 BBB 渗透，MMP-9 活性，情境恐惧条件反射中的表现受损以及新的对象识别任务。MMP-9 的敲除可挽救认知障碍和顺铂诱导的 SHSY5Y 细胞中 HMGB1 的上调。HMGB1 / TLR4 / IP3K / AKT 信号传导有助于增加 RAW264.7 细胞中的 MMP-9 活性。原花青素治疗可减弱 MMP-9 活性、BBB 损伤和 CICI。（4）结论：结果表明，CICI 中涉及 MMP-9 活化和 BBB 破坏。原花青素可以有效缓解顺铂的有害作用。

　关键字：

　顺铂; 化疗;MMP-9;RAW264.7 电池; 原花青素; 血脑屏障; 血脑屏障; 化疗诱导的认知障碍 （CICI ）

　1. 引言 化疗药物是一些最有效的抗癌治疗形式。随着化疗药物的出现，癌症患者的存活率有了很大的提高。然而，它们与许多不良副作用有关，例如心脏毒性，周围神经毒性和肝毒性。最近，化疗诱导的认知障碍（CICI），也称为“化疗脑”，正日益得到认可[1，2]。此外，在癌症患者中，甚至在化疗后，通常观察到它[3]。CICI 的认知障碍包括言语和视觉记忆，精神运动功能，学习困难和注意力持续时间差。在临床环境中，CICI 是化疗后常见的神经系统并发症，可能影响高达 78%的治疗患者，与生活质量受损密切相关，并阻碍职业目标的实现[4]。因此，迫切需要了解潜在的机制，并找到一种安全有效的策略来预防认知障碍。

　有几种潜在的机制和病因导致 CICI，包括直接神经毒性，氧化应激增加，血脑屏障（BBB）破坏和继发性神经炎症反应。例如，顺铂可以直接引起神经毒性损伤。它是一种 DNA 靶向剂，形成有毒的铂 DNA 加合物并诱导坏死和细胞凋亡[5]。受损细胞导致外周循环细胞因子上调，外周循环细胞因子招募免疫细胞以诱导神经元凋亡，即使在低浓度下也会导致认知障碍[6，7，8]。BBB 破坏导致外周化疗药物和病原体精确进入神经组织，被认为是许多认知能力下降相关疾病的病理学和进展的关键[9，10]。因此，了解化疗药物诱导的 BBB 完整性变化的机制将为预防 CICI 提供新的见解。

　众所周知，基质金属蛋白酶-9/2（MMP-9/2）与 BBB 的分解密切相关，从而促进许多其他疾病的神经元和突触功能障碍。MMP-9 / 2 可以由许多细胞产生，包括巨噬细胞。它不仅可以切割血管基底层和/或细胞之间的紧密连接，然后增强 BBB 通透性，而且还被认为是脑生理学和病理学中一个主要且明显独特的参与者[11，12]。MMP-9 促进炎症细胞浸润，其在神经炎症和认知能力下降中的作用已得到充分评价[13]。有趣的是，最近有报道称 MMP-9 的上调与化疗诱导的周围神经毒性（CIPN）有关[14，15]，而 MMP-9/2 在 CICI 中的作用尚未得到评估。

　值得注意的是，顺铂诱导细胞死亡并促进外周血系统中释放的损伤相关分子模式（DAMPs）。DAMPs 是最关键的炎症和免疫反应触发因素[15，16]。例如，高迁移率基团蛋白 B1（HMGB1）和 Toll 样受体（TLR2 / TLR4）信号级联反应有助于表型切换到 M1 巨噬细胞极化和 MMP-9 的上调（refs.[17，18]），这与认知障碍疾病有关。晚期糖基化终产物（RAGE）的受体是上调 MMP-9 信号传导的另一个候选者。它是信号转导受体，可感知包括 HMGB1 和氧化应激在内的信号分子，并且可以促进核因子 kB（NF-kB）激活和各种细胞因子和 MMP-9 的分泌。然而，巨噬细胞中有助于 CICI 发展的 MMP-9 尚未得到充分理解。

　几种具有神经保护特性的天然产物在顺铂神经毒性作用的改善中得到证实[7]。例如，据报道，化疗药物 N-乙酰半胱氨酸[19]、人参皂苷 Rg1 [20]或姜黄素的给药可减弱顺铂诱导的认知能力下降[21]。原花青素是一种类黄酮，主要存在于葡萄籽和绿茶中。已经证明它具有强大的氧自由基吸收能力，可以减轻神经性疼痛和化疗诱导的周围神经病变（CIPN）[14，22]。此外，

　先前的研究报道，原花青素对巨噬细胞中的 MMP-9 和 NF-κB 信号传导具有有效的抑制作用，可缓解神经性疼痛或炎症性肠病[23]。据报道，它还可抑制活化单核细胞产生 HMGB1 危险信号[24]。

　迄今为止，还没有研究关注葡萄籽提取物是否可以减轻 CICI。MMP-9 相关 BBB 完整性变化在 CICI 中的贡献尚未得到调查。在本研究中，我们专注于顺铂诱导的 MMP-9 / 2 活性和 BBB 完整性的变化。此外，我们进一步测试了 HMGB1 信号在巨噬细胞 MMP-9 / 2 上调中的作用。最后，我们将评估原花青素在衰减 CICI 以及 MMP-9 和 BBB 渗透的产生中的作用。

　2. 材料和方法 2.1. 动物

　所有动物都按照良好的动物规范进行处理。动物工作得到了中国徐州徐州医科大学相关委员会的批准。野生型小鼠（C57BL / 6J，12-14 周龄）由中国徐州医科大学实验动物中心提供。MMP-9 突变体 （MMP-9 −/− ）小鼠是从杰克逊实验室（美国缅因州巴港）购买的。将五只小鼠在无病原体条件下的笼子中饲养，在 12 小时的光/暗循环和受控温度（22±2°C）下。

　药物、化学药品

　原花青素是从阿拉丁有限公司（中国上海）购买的。二抗是从 Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利）购买的。Toll 样受体 4 （TLR-4）抑制剂 TAK-242，磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）抑制剂 AS-605240 和蛋白激酶 B（Akt）抑制剂 GSK690693是从 Selleck Chemicals（中国上海）购买的。RAGE 抗体 553030 是从 Calbiochem（德国达姆施塔特默克）购买的。抗 HMGB1多克隆抗体 326052233 从 SHINO-TEST 株式会社（日本相模原市）购买，GAPDH 从中国武汉的 Proteintech 购买。明胶是从Amresco（美国俄亥俄州索伦）购买的。酶图变性缓冲液和显影缓冲液是从 Novex（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）购买的。FBS 从 Gibco（美国纽约州格兰德岛）购买，其他细胞培养基和补充剂从 HyClone（美国犹他州洛根）购买。所有其他化学品都是从西格玛化学公司（美国密苏里州圣路易斯）购买的。

　顺铂和原花青素的给药

　为了测试 MM-9 / 2 在 CICI 中的作用，将动物分为两个不同的组，载体组（Veh）和顺铂组（Cis）。每只小鼠顺铂的总累积剂量为 34.5mg / kg。根据先前的一项研究，顺铂（2.3mg/kg，溶于生理盐水）或载体（生理盐水）腹腔注射（ip）3 个周期，包括 5 次日注射，然后休息 5 日[25]。

　为测试原花青素在 CICI 中的治疗作用，将动物分为 6 组：载体组（Veh），顺铂组（Cis），顺铂加 10 原花青素组（10 mg / kg，p.o.），顺铂加 20 原花青素组（20 mg / kg，p.o.），顺铂加 40 原花青素组（40mg / kg，p.o.），40 原花青素组（40mg / kg， p.o.）。原花青素（10，20，40mg / kg，口服）或载体（盐水，口服）在顺铂治疗前 1 小时施用。

　2.4. 恐惧条件反射

　情境恐惧调节在自动化系统（Med Associates， Inc.，圣奥尔本斯，VT，美国）中进行，包括单次暴露于环境（3 分钟）和足部电击（2 s;0.7 mA;恒定电流）[26]。在恐惧调节范式之后，通过返回同一房间对小鼠进行 3 分钟的评分。在 180 秒内每训练 10 秒 24 小时由不了解实验条件的观察者测量上下文相关冻结，并以观察总数的百分比表示。

　2.5. 对象识别测试

　（ ORT ）

　ORT 是在一个由圆形（30 厘米）白色 Plexiglas 竞技场，白色 Plexiglas 墙（40 厘米高）和黑色塑料覆盖的地板组成的设备中进行的。每只动物都被放置在没有物体的竞技场中进行习惯。训练课程（熟悉的对象）在一小时后进行。每只老鼠被放置在竞技场中，有一对相同的物体（A1 和 A2）。在训练阶段，允许动物自由探索 10 分钟。动物去了测试会议（5 分钟）。将小鼠放置在竞技场中，其中有一个物体（A1 或 A2，熟悉的物体）和一个新物体（B，新颖的物体）。“辨别指数可以量化实验动物对新事物的偏好”。“辨别指数”一般用 D2（d2）来表示，D2（d2）是动物在试验期间对新事物的探索时间，也是对熟悉物体的探索时间。按次数计算，具体公式为：D2 = （N − F）/（N + F），其中“N”表示动物在测试期间探索新物体的次数，“F”表示动物熟悉测试期。对象探索的数量，即“辨别指数”，考虑了动物之间不同层次的探索活动。ORT 指数与工作记忆水平有关[27]。

　明胶酶图

　对动物进行麻醉，并如前所述在 1%NP40 裂解中快速解剖和组织均质化[22]。接下来，将每条泳道 300-500μg 蛋白质加载到预制凝胶（含有 0.1%明胶的 8%聚丙烯酰胺凝胶）的孔中。电泳后，将每个凝胶与 50mL 显影缓冲液在振荡浴中孵育 48小时（37.5°C）。然后将凝胶用考马斯亮蓝色（1%，用 10%乙酸，10%异丙醇，用 dd H 稀释）

　2 O). 2.7. 体内埃文斯蓝色测定法测试脑血管通透性

　Evans Blue 是一种结合白蛋白的染料[28]。当血管通透性内皮细胞变得通透时，可以检测到由 Evans Blue 标记的白蛋白。在动物处死前，腹膜内注射 2%的 Evans Blue 溶液在生理盐水中（4mL / kg 体重）1 小时。之后，处死小鼠，并收集脑组织进行进一步测试。然后将样品在 PBS 中匀浆并离心（15 分钟，15，000 rcf，4°C）。向每个 500μL 等分试样，将等量的 50%三氯乙酸加入到上清液中，然后孵育（过夜，4°C）。最终离心样品（30 分钟，15，000 rcf，4°C），并用分光光度计（RF-540，岛津公司，日本东京）在 632nm 处测量。结果呈现为埃文斯蓝染色）/（组织 g）。

　细胞制备、刺激

　SHSY5Y 细胞和 RAW264.7 细胞维持在加湿的 5%CO 中 2 在 37°C 下，在 Dulbecco 的改良鹰培养基（DMEM）中补充 10%（v / v）FBS，青霉素（100 U / mL）和链霉素（100 U / mL）。为了诱导炎性小体活化，将细胞接种在 6 孔板中过夜。将培养基更换为无血清培养基，然后用顺铂（1μM）处理 SHSY5Y 细胞 8 小时[29]。然后，我们更换了 Dulbecco 的改良 Eagle培养基（DMEM），补充了 10%（v / v）FBS 并继续培养 8 小时。在 0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h 和 8 h 收集 SHSY5Y 细胞的细胞上清液，进行进一步的 HMGB 1 和 GAPDH 蛋白质印迹检测。16 小时后，我们将 SHSY5Y 细胞（已被激活并以时间依赖性方式释放高水平 HMGB-1 的细胞）的细胞上清液添加到 RAW264.7 细胞中。实验采用 TRL-4 抑制剂 10 μM、PI3K 抑制剂 10 μM、Akt 抑制剂 1 μM 和 RAGE 抑制剂 10 μM。然后用明胶酶法分析 RAW264.7 细胞上清液。

　蛋白质印迹

　收集 SHSY5Y 细胞的细胞上清液，并在 RIPA 裂解中匀浆。蛋白质浓度通过 BCA 蛋白质测定法测定（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆费希尔）测定。SDS-PAGE 用于通过在每个凝胶中上样 30-60μg 蛋白质来分离不同重量的蛋白质。然后将分离的蛋白质电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上（Millipore Corp.，贝德福德，马萨诸塞州，美国）。将含有靶蛋白的膜在室温下用 5%牛血清白蛋白封闭 2 h，用抗体在 4°C 下用一抗探查过夜，然后与 HRP 偶联的二抗一起孵育。一抗使用抗 HMGB1（1：1000）和 GAPDH（1：2000）。使用分子成像仪（Gel DocTM XR，170-8170）获取数据，并使用数量一-4.6.5（Bio-Rad 实验室，加州伯克利，美国）进行分析。

　资料分析

　Prism 9.0 for Mac（GraphPad， La Jolla， CA， USA）用于计算平均值和 SEM 并执行统计分析。我们通过单向或双向方差分析了多个组均值，然后在适当的情况下进行了 Tukey 的多重比较检验。我们使用未成对 t 检验进行两组均值比较。p值小于 0.05 被认为是显著的。

　3. 结果 顺铂诱导的认知障碍，血脑屏障障碍和海马体中 MMP-9 活性的上调的反复治疗

　为了确认重复使用顺铂是否会损害认知功能，我们对有或没有顺铂的小鼠进行了两种不同的行为评估。通过进行恐惧调节行为测试，我们观察到顺铂组（未成对 t 检验，p <0.0001，图 图 1B）与载体组相比，存在显着的记忆障碍。我们进一步进行了ORT 来测量海马依赖性短期工作记忆。与恐惧调节试验结果一致，顺铂也损害了短期工作记忆（未成对的 t 检验，p = 0.0003，图 图 1C）。我们通过检查海马体中的 Evans Blue 泄漏来进一步评估 BBB 功能。结果显示，顺铂导致埃文斯蓝提取水平升高（未成对的 t 检验，p = 0.0065，图 图 1D）。我们对顺铂诱导的 BBB 破坏发生的原因感兴趣。MMP9 / 2 被建议破坏许多疾病的 BBB

　功能。因此，我们探索了海马体中 MMP-9 / 2 的变化。有趣的是，顺铂也显着增加了 MMP-9 活化（p = 0.0262 图 图 1E，F），而组间 MMP-2 活化没有变化（图 图 1G）。

　图 图 1.顺铂诱导的认知障碍、BBB 中断和海马 MMP-9 水平升高的重复治疗。（A）

　行为范式。（B）顺铂反复输注后冷冻行为缺陷。n = 8。（C）顺铂反复输注后新型目标识别试验的缺陷。n = 8。（D）埃文斯蓝在海马组织中的提取值。n = 5。（E）明胶酶图显示顺铂诱导的海马 MMP-9 和 MMP-2 的活性变化。（F）MMP-9 的折叠变化。（G）

　MMP-2 的折叠变化。n = 5，未配对 的 t 检验（p * <0.05，p **<0.01，p *** <0.001，p **** <0.0001 顺铂与载体）。

　这些数据显示，MMP-9，而不是 MMP-2，可能导致顺铂诱导的 BBB 损伤。我们进一步研究了 MMP-9 小鼠的靶向系统突变，以证实这一假设。与 WT 小鼠相比，重复顺铂治疗仅诱导 MMP-9 中轻微的上下文相关记忆丧失。

　−/− 小鼠（单因子方差分析，p = 0.0236，图 图 2B）。根据恐惧条件反射试验结果，顺铂还损害了短期工作记忆（单向方差分析，p <0.0001，图 图 2C）。这些结果进一步证实了 MMP-9 在顺铂相关认知障碍中的关键作用。

　 图 图 2.MMP-9 靶向系统突变对顺铂诱导的记忆障碍的影响。（A）

　行为范式。（B）MMP-9 靶向突变对顺铂诱导的冷冻行为缺乏的影响。n = 5~8...

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